近日，437ccm必赢国际羊遗传改良与生物育种团队联合国内多家单位在线粒体碱基编辑工具开发方面取得新进展。研究以“Enhanced C-To-T and A-To-G Base Editing in Mitochondrial DNA with Engineered DdCBE and TALED”为题发表于国际学术期刊《 Advanced Science 》。437ccm必赢国际羊遗传改良与生物育种团队王小龙教授、上海交通大学医学院李文教授、章美玲副研究员及上海脑科学与类脑研究中心/临港国家实验室胥春龙研究员为论文共同通讯作者。魏迎辉教授、博士研究生黄舒泓、硕士研究生姚方瑶及福建医科大学金铭博士为论文的共同第一作者。本研究得到437ccm必赢国际羊遗传改良与生物育种团队陈玉林教授及辉大基因杨辉研究员的大力支持。

线粒体是细胞的“能量工厂”，可为细胞活动源源不断提供能量。脊椎动物线粒体基因组长度约为16 kb，共有37个基因，包括13条多肽，22个tRNA基因和2个rRNA基因，共同参与线粒体内的整个氧化磷酸化过程。动物线粒体基因组因其具有在世代间没有基因重组、呈现严格母系遗传、拷贝数高等特点被广泛用于动物起源进化、物种鉴定、疾病诊断、衰老及动物经济性状的核外基因效应研究。借助线粒体碱基编辑工具从基因组角度研究线粒体遗传变异与畜禽经济性状表型的关联分析，对于建立新的核外遗传分子标记和品种选育具有实际应用价值，同时对于核外遗传学具有重要的理论和科学意义。

2020年，David Liu团队利用TALE与双链DNA脱氨酶DddA融合，研发了线粒体碱基编辑工具DdCBE，其可针对双链线粒体DNA（mtDNA）实现C>T的碱基编辑，但只能对5’-TC有较高的编辑效率，因此限制了其应用范围。针对这一问题，国内外多个科学家团队通过挖掘DddA同源蛋白，克服了DdCBE工具受DNA序列的编辑限制。2022年，Jin-Soo Kim团队利用DddA在打开mtDNA双链的同时，通过融合单链腺嘌呤脱氨酶TadA8e (该系统命名为TALED)，实现了mtDNA上A>G的碱基编辑，但效率较低。

本研究通过在DdCBE系统基础上融合10种具有单链DNA活性的胞嘧啶脱氨酶，其中来自 Xenopus laevis 的AID (activation-induced cytidine deaminase)（简称xAID）展现出较高的碱基编辑活性，同时表现出较强的5’-GC偏好性（图1）。另外，研究人员在DddA11-xAID基础上通过引入已报道的DddA高保真位点和多种核输出信号（nuclear export signal, NES) 序列，同时通过全基因组测序、全线粒体高通量测序和扩增子测序系统评估了优化的DdCBE工具的mtDNA和核DNA脱靶活性，发现DddA11-T1391A-xAID-NES2版本具有编辑活性高、范围广及特异性强的特征。

图1. 引入单链DNA活性的胞嘧啶脱氨酶显著提高了DdCBE系统C-to-T碱基编辑活性

其次，研究人员通过替换TALED系统中的DddA元件为DddA6，显著性地提高了mtDNA中A>G的碱基编辑效率（最高达18倍）（图2）。与DdCBE系统优化方案相似，作者们通过进一步引入已报道的DddA高保真位点和多种NES序列，同时通过全基因组测序、全线粒体高通量测序和扩增子测序系统评估了优化的TALED工具的mtDNA和核DNA脱靶活性，发现DddA6-Q1310A-AD-V106W-NES1版本具有编辑活性高及特异性强的特征。

图2. 替换TALED系统中DddA为DddA6显著提高了其A-to-G碱基编辑活性

最后，研究人员利用工程化的DdCBE工具（DddA11-T1391A-xAID-NES2）和TALED工具（DddA6-Q1310A-AD-V106W-NES1）结合split-DddA_tox的位置和方向，针对具有5’-GC偏好性、可模拟Leber遗传性视神经病变（m.3635G>A）位点和可模拟线粒体神经肌肉综合症（m.10010T>C）位点，在HEK293T细胞系上分别成功构建了可模拟这两种疾病的线粒体基因突变，发现这些突变会引起线粒体功能紊乱，例如出现ATP水平、线粒体呼吸链复合体I和IV水平降低及ROS水平上升等异常情况（图3）。

图3. 利用工程化的DdCBE和TALED系统成功构建了模拟人类线粒体疾病的细胞模型

综上，本研究优化的DdCBE和TALED工具显著提高了线粒体基因组的靶向编辑效率、特异性或序列兼容性，对推动动物线粒体基因组的遗传修饰具有重要意义。

本研究得到国家“科技创新-2030”重大专项、国家自然科学基金、国家现代农业产业技术体系、陕西省“两链融合”重大专项和437ccm必赢国际人才项目等项目资助，同时感谢我校高性能计算平台的支持。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202304113